Стрептококк пневмонии окраска по граму

Методические рекомендации

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Ю.В.Демина), ГБОУ ВПО ПГМУ им.ак.Е.А.Вагнера Минздрава России (И.В.Фельдблюм, Ю.А.Захарова, В.В.Николенко, Н.Н.Воробьева, С.О.Голоднова, А.В.Климашина), МБУЗ “Городская клиническая больница N 8” г.Челябинска (О.А.Орлова), ФБУН “Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии” Роспотребнадзора (В.В.Малеев, Г.А.Шипулин, С.Б.Яцышина, К.О.Миронов), “Научно-исследовательский институт антимикробной химиотерапии” ГБОУ ВПО “Смоленская ГМА” Минздрава России (Р.С.Козлов, С.А.Рачина), ФГБУ “Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалея” Минздрава России (И.С.Тартаковский), ФГБУЗ “Научно-исследовательский институт детских инфекций” ФМБА России (С.В.Сидоренко, В.В.Гостев, М.О.Волкова).

2. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю.Поповой 20 октября 2016 г.

1.1. Настоящие методические рекомендации (далее – МР) определяют порядок лабораторной диагностики заболеваний, в первую очередь пневмоний пневмококковой этиологии.

1.2. Методические рекомендации предназначены для специалистов организаций, осуществляющих лабораторную диагностику заболеваний органов дыхания, индикацию патогенов инфекций верхних и нижних дыхательных путей.

БАЛ – бронхоальвеолярный лаваж

ВКО – внутренний контрольный образец

ВОЗ – всемирная организация здравоохранения

ВП – внебольничная пневмония

ГЭ/мл – количество геном-эквивалентов в 1 миллилитре

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ИХА – иммунохроматографический анализ

КОЕ/мл – колониеобразующие единицы в 1 миллилитре

МО – медицинская организация

МПК – минимальная подавляющая концентрация

МУ – методические указания

– никотинамидадениндинуклеотид

OК – отрицательный контроль экстракции

ОРВИ – острая респираторная вирусная инфекция

ОРИТ – отделение реанимации и интенсивной терапии

ПК – положительный контроль экстракции

ПЦР – полимеразная цепная реакция

СМЖ – спинномозговая жидкость

СП – санитарно-эпидемиологические правила

УФ-бокс – ультрафиолетовый бокс

ФКР – Федеральные клинические рекомендации

ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота

CNA-aгap – селективный агар для выделения грамположительных бактерий с налидиксовой кислотой и колимицином

EUCAST – European on Antimicrobial Susceptibility Testing (Европейская система тестирования антимикробной восприимчивости)

Пневмонии – группа различных по этиологии, патогенезу, морфологической характеристике острых инфекционных заболеваний, характеризующихся поражением легких с обязательным наличием внутриальвеолярной экссудации, сопровождающихся симптомами патологии нижних отделов дыхательных путей (лихорадка, кашель, выделение мокроты, возможно гнойной, боль в грудной клетке, одышка) и рентгенологическими признаками “свежих” очагово-инфильтративных изменений в легких при отсутствии очевидной диагностической альтернативы. Внебольничной пневмонией считают заболевание, возникшее во внебольничных условиях (вне стационара или позднее 4 недель после выписки из него) или диагностируемое в первые 48 часов с момента госпитализации, а также развивающееся у пациента, не находившегося в домах сестринского ухода длительного медицинского наблюдения более 14 суток.

По данным федерального статистического наблюдения (форма N 2 “Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях”), за 2011-2014 гг. заболеваемость ВП в России находилась на уровне 310-380 на 100 тыс. населения (600-750 случаев на 100 тыс. детей в возрасте до 14 лет).

У отдельных категорий граждан, в частности у военнослужащих срочной службы, медицинских работников, заболеваемость пневмококковыми пневмониями превышает уровень заболеваемости среди населения в целом.

Показатель смертности при ВП в 2011-2014 гг. составлял 2,9-3,9 на 100 тыс. населения (у детей в возрасте до 14 лет – 0,3-0,4 на 100 тыс.). В структуре младенческой смертности заболевания органов дыхания стоят на третьем месте (около 7%), из них около 74% приходится на пневмонии.

Этиологическая структура ВП может различаться в зависимости от возраста пациентов, тяжести заболевания и наличия сопутствующей патологии. По зарубежным данным, пневмококковые пневмонии диагностируют у 5% взрослых амбулаторных пациентов, 17,3% госпитализированных в терапевтические отделения и 21% – в отделения интенсивной терапии. В Российской Федерации по расчетным данным частота пневмококковых пневмоний у детей в возрасте от 1 месяца до 15 лет составляет 490 случаев на 100000 детского населения соответствующего возраста, в возрасте от 1 месяца до 4 лет – 1060 случаев.

Дети первых лет жизни являются основными источниками пневмококковой инфекции, заражая окружающих взрослых. Так, при средней частоте носительства у взрослых в 5-7%, среди взрослых, проживающих с детьми, она может достигать 30%.

По данным отчетной формы государственного статистического наблюдения в России (ф-2), пневмококковая этиология ВП подтверждается лишь в 1,3% случаев.

Создавшаяся ситуация требует поиска новых диагностических подходов и разработки алгоритмов выявления S. pneumoniae, включая стандартизацию бактериологических и серологических тестов, внедрение в работу практической медицины современных молекулярно-биологических и иммунохроматографических способов детекции возбудителя.

Возбудитель пневмококковой пневмонии, S. pneumoniae или пневмококк, входит в состав семейства Streptococcaceae, род Streptococcus, как вид условно-патогенных бактерий. Пневмококки – грамположительные каталазо- и оксидазоотрицательные мелкие шаровидные бактерии (кокки), являющиеся факультативными анаэробами.

При микроскопии часто имеют ланцетовидную форму, располагаются парами (диплококк), нередко имеют капсулу. Из жидких питательных сред под микроскопом визуализируются цепочками средней длины. При искусственном культивировании пневмококк нуждается в специальных питательных основах, обогащенных дефибринированной кровью животных. Рост возбудителя в искусственных условиях культивирования стимулирует повышенное содержание в атмосфере СО.

На плотных питательных средах пневмококк образует мелкие (1-2 мм в диаметре), округлые, блестящие, бесцветные колонии с ровным краем, мягкой консистенции, которые в большинстве случаев через 24 часа инкубации имеют сферическую форму с уплощенным центром, образующимся в результате аутолиза (шероховатая R-форма).

На 5%-м кровяном агаре вокруг колоний пневмококка характерно образование зеленящей зоны альфа-гемолиза. Наиболее вирулентные капсульные бактерии могут располагаться в виде капель росы, в последующем принимая сливной рост (мукоидная М-форма). Гладкие, компактные, точечные колонии (S-форма) преобладают у авирулентных штаммов.

Рост S. pneumoniae на жидких питательных средах характеризуется диффузным помутнением бульона без образования пленки.

Биохимическая активность пневмококка во многом совпадает с активностью других зеленящих стрептококков: он разлагает глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, не ферментирует маннит, салицин и сорбит, однако в отличие от других представителей зеленящих форм стрептококков не обладает способностью к росту при температуре 45°С.

Видовая специфичность пневмококка выражается в способности ферментировать инулин, чувствительности к оптохину и солям желчных кислот (дезоксихолату и таурохолату натрия). Вместе с тем в последние годы появились изоляты, устойчивые к оптохину (до 10% от всей популяции).

Вирулентность пневмококка в первую очередь обусловлена наличием полисахаридной капсулы, обеспечивающей антифагоцитарную активность, а также протеина адгезии, протеазы секреторного IgA, тейхоевой кислоты и фрагментов пептидогликана, активизирующих комплемент по альтернативному типу.

В зависимости от химического строения капсульного полисахарида выделяют более 90 серологических типов S. pneumoniae: серогруппы (обозначаются цифрами, например: серогруппа 6) и входящие в них серотипы (обозначаются буквами, например: серотип 6А). Определение серологических типов проводится с использованием серологических методик, основанных на реакции набухания капсулы в присутствии иммунной сыворотки или в реакции латкес-агглютинации. Альтернативным способом определения серогрупп (серотипов) является детекция специфических локусов бактериальной ДНК, вовлеченных в биосинтез капсульного полисахарида, с помощью различных ПЦР-методик или секвенирования ДНК.

Более 90% инвазивных заболеваний вызывается 23 серотипами возбудителя, которые входят в широко используемую в настоящее время полисахаридную вакцину (1, 2, 3, 4, 5, 6В 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 1-9F, 19А, 20, 22F, 23F, 33F).

Спектр антибиотикорезистентности пневмококка зависит от географического места изоляции и вида материала, из которого изолирован штамм (мазок из носоглотки, спинномозговая жидкость и др.). В России уровень устойчивости пневмококков, выделенных из нестерильных локусов, к пенициллинам (МПК>0,06 мг/л) составляет в среднем 11%, к макролидам – 7%, к тетрациклинам – 25%, к ко-тримоксазолу – 39%. Полирезистентностью (устойчивостью к 3 и более классам антимикробных препаратов) обладает 14,5% штаммов пневмококка, большинство из которых (>90%) выделено из респираторных образцов. Пневмококки 23-й, 19-й и 6-й серогрупп (серотипы 23F, 19F, 19А, 6В) часто характеризуются повышенной устойчивостью к пенициллину и другим антибактериальным препаратам, а также могут обладать полирезистентными свойствами, что обусловлено генетическими мутациями циркулирующих возбудителей.

Микроскопическое исследование относится к простым ускоренным методам обнаружения S. pneumoniae, позволяющим получить предварительный результат. Бактериоскопия окрашенного по Граму мазка определяет морфотип потенциального бактериального патогена. Ценность метода и решаемые задачи различаются в зависимости от того, из какого локуса организма отобран клинический материал.

Модифицированным вариантом микроскопии в комбинации с серологической диагностикой S. pneumoniae является метод Нейфельда или феномен набухания капсулы при взаимодействии с неразведенной специфической антипневмококковой сывороткой (I, II, lll типов) в присутствии синьки Лёффлера. Метод основан на способности капсул пневмококков увеличиваться в объеме в присутствии гомологичной антисыворотки, что регистрируют светооптической микроскопией. При положительном результате наблюдается резкое увеличение капсул пневмококков. При отрицательном результате капсулы едва заметны. Реакция набухания специфична и не дает положительного результата с другими капсульными бактериями, однако с его помощью невозможно идентифицировать не имеющие капсулы S. pneumoniae.

Пневмококки, имеющие капсулу, также можно визуализировать по методу Бурри-Гинса. По Бурри материал перемешивают с тушью, на фоне которой будут выделяться неокрашенные бактерии и капсулы. В модификации Гинса приготовленный по Бурри препарат дополнительно окрашивается фуксином Циля, при этом бактерии приобретают ярко малиновую окраску, а их капсулы остаются неокрашенными.

У пациентов, принимавших антибактериальные препараты, данные методы могут давать ложно-отрицательные результаты, поскольку в этом случае в клиническом материале могут присутствовать пневмококки, лишенные капсулы. Следует помнить, что при переходе S. pneumoniae из S в R-форму капсульные антигены утрачиваются.

Бактериологический метод позволяет выделить “чистую” культуру возбудителя, провести его видовую идентификацию и серотипирование, определить чувствительность к антимикробным препаратам.

Основной сложностью при выделении культуры пневмококка является требовательность к условиям культивирования и склонность микроорганизма к быстрому аутолизу (саморазрушению). Ограничением метода может быть сложность получения мокроты и значительная продолжительность исследования (результат определяется спустя 48-72 часа с момента забора биологического материала). Диагностическая ценность будет ниже при исследовании крови и широком использовании антимикробных препаратов на догоспитальном этапе (низкий уровень высеваемости).

Отправной точкой идентификации пневмококков на кровяном агаре является гемолитическая реакция стрептококков. S. pneumoniae – гемолитический (зеленящий) стрептококк, который по морфологическим признакам роста трудно отличим от идругих гемолитических (“зеленящих”) стрептококков – S. mitis, S. oralis, S. sanguis, S. parasanguis, S. gordonii.

Признаками, подтверждающими видовую принадлежность изолята, являются его морфология (грамположительные кокки), отсутствие каталазо- и оксидазообразования, чувствительность к оптохину и лизис солями желчи. Оптохин (этилгидрокупреина гидрохлорида) селективно подавляет рост пневмококка в отличие от других “зеленящих” стрептококков. Соли желчи (в особенности дезоксихолат натрия и таурохолат натрия) обладают способностью избирательно лизировать колонии S. pneumoniae на агаре или в бульоне. Метод основан на активации пневмококковых аутолизинов – ферментов, участвующих в синтезе клеточной стенки, что приводит к визуальному лизису S. pneumoniae в течение 0,5-2 ч. Однако примерно для 14% пневмококков наблюдается неполный лизис. Дифференциальная диагностика S. pneumoniae проводится с прочими представителями рода Streptococcus: S. pseudopneumoniae (чувствительного к оптохину, но устойчивого к желчи), S. pyogenes группы А (чувствительного к бацитрацину и положительного в ПИРА-тесте), S. agalactiae группы В (положительного в тесте с гиппуратом Na и САМР-тесте), зеленящими стрептококками группы S. viridans (как правило, растущих в тиогликолевой среде при температуре 45°С). От представителей других родов: Neisseria spp., Haemophilus spp. и Corynebacterium spp., дающих схожий рост на средах первичного посева с атипичными формами пневмококков, их отличают морфология, оксидазная и каталазная активность.

Необходимо помнить, что в современной популяции до 10% изолятов пневмококков устойчивы к оптохину, они также резистентны и к бета-лактамным антибиотикам. В то же время рост некоторых “зеленящих” стрептококков подавляется оптохином.

Принадлежность S. pneumoniae, устойчивых к оптохину, необходимо подтверждать с использованием комплекса тестов, дифференцирующих между собой различные виды стрепрококков, с помощью тест-систем коммерческого производства, разрешенных к применению в Российской Федерации.

К сожалению, один из современных методов идентификации бактерий по белковому профилю, MALDI-масс-спектрометрия, не может быть использован для идентификации S. pneumoniae в связи с высоким сходством белкового профиля различных видов гемолитических стрептококков.

Конечным этапом бактериологической диагностики S. pneumoniae является определение чувствительности к антибиотикам. В настоящее время теоретически обоснованным считается подход к оценке чувствительности, предлагаемый Европейским сообществом (European on Antimicrobial Susceptibility Testing – EUCAST), основанный на признании факта существования различий между микробиологической и клинической чувствительностью/устойчивостью микроорганизмов. Для обоснования клинических критериев EUCAST использует фармакокинетические/фармакодинамические закономерности зависимости между величиной МПК антибактериального препарата в отношении микроба-возбудителя, фармакологическими характеристиками препарата и эффективностью лечения.

К способам обнаружения антигена пневмококка с целью его ускоренного выявления может быть отнесен метод латекс-агглютинации, основанный на выявлении пневмококковых капсульных полисахаридных антигенов с применением поливалентной специфической пневмококковой сыворотки. Антиген, содержащийся в исследуемом образце, взаимодействует со специфичными гомологичными антителами, которыми покрыты латексные частицы. В присутствии гомологичного антигена латексные частицы агглютинируют. В отсутствии антигена, они остаются в виде гомогенной суспензии.

Исследование проводят непосредственно с чашки первичного посева. Можно использовать сам биологический материал, как правило, ликвор или сыворотку крови. Быстроту получения результата и простоту теста могут нивелировать перекрестные реакции с антигенами других стрептококков. К преимуществам метода относят быстроту и простоту исполнения, к недостаткам – высокую стоимость, невозможность определения антигена в нестерильном биологическом материале.

В последние годы все большую популярность приобретают быстрые тесты “у постели больного”, в частности иммунохроматографический экспресс-тест для выявления пневмококкового клеточного полисахарида (с-полисахарида) в моче.