Клеточные технологии для лечения ожогов

Кожа – быстро обновляющийся орган, в ней много региональных стволовых клеток, и она обладает высокими регенеративными возможностями. Небольшие травматические повреждения кожи, как правило, быстро заживают, но в некоторых случаях – тяжелые травмы, глубокие ожоги, нарушения кровоснабжения и т.д. – требуется специальное лечение. Остаётся актуальной проблема восстановления эпителиального покрова после ожоговой травмы, косметических операций и других состояний, сопровождающихся утратой значительной части кожи. Метод выбора в широкой клинической практике – аутодермопластика. Ее основными недостатками являются дополнительная кожная рана в месте забора лоскута и невозможность применения этой технологии при обширных поражениях (Valencia et al. 2000, Qaryoute et al. 2001, Ehrlich 2004). Для лечения глубоких ожогов, хронических язв и обширных повреждений постоянно разрабатываются новые покрытия, заменяющие кожу либо ускоряющие эпителизацию аутотрансплантированных лоскутов. Во многих случаях лучшие результаты дает применение методов клеточной терапии.

Первые сообщения о культивировании клеток кожи появились еще в 40-х годах. В 70-х годах было предложено использовать культивируемые клетки кожи (кератиноциты) при лечении ожогов (Rheinwald, Green 1975). С 80-х годов данный метод используется во многих странах мира, в том числе в ведущих ожоговых центрах России (Институт хирургии им. Вишневского РАМН, Московский городской детский ожоговый центр, Военно-медицинская академия, г. С.-Петербург). В настоящее время сформировались два основных направления в области использования культивированных клеток для лечения тяжело обожженных:

Первое заключается в использовании для закрытия ожоговых поверхностей пластов культивированных кератиноцитов (клеток покровного эпителия), полученных чаще всего из аутоклеток (Hunyadi et al. 1987; Thompson et al. 1987; Туманов и др. 1989; Compton et al. 1989; Teepe et al. 1990; Terskikh, Vasiliev 1999), значительно реже — из аллокератиноцитов (De Luca et al. 1989; Duinslaeger et al. 1996; Oshima et al. 2002). Хотя аллотрансплантат не приживается, он обеспечивает закрытие раневой поверхности и модулирует пролиферацию и дифференцировку клеток эпителия реципиента, тем самым стимулируя регенерацию (Oliver et al. 1991; Phillips, Gilchrest 1991).

Уже на первых этапах клинического применения трансплантатов из культивированных аутокератиноцитов определился ряд недостатков, препятствующих их широкому клиническому использованию:

–>использование аутокератиноцитов не дает возможности создать банк клеток;

–>сроки, необходимые для изготовления достаточного по площади трансплантата, велики и составляют 3-4 недели (Navsaria et al. 1995);

–>длительные сроки получения трансплантатов увеличивают риск развития инфекционных осложнений ожоговой болезни и удлиняют время пребывания пациентов в стационаре;

–>аутокератиноциты практически не приживаются при трансплантации на гранулирующие ожоговые раны (De Luca et al. 1989; Туманов и др. 1989);

–>высока стоимость специальных ростовых сред и биологически активных стимуляторов роста кератиноцитов.

Второе направление предусматривает использование для закрытия раневых поверхностей так называемых эквивалентов кожи, которые включают не только культивированные кератиноциты, но и дермальный эквивалент, состоящий из коллагена, гликозамин-гликанов и др. (Asselineau et al. 1986; Nanchahal 1989, Dvorankova et al. 2003). Современные «живые эквиваленты кожи» представляют собой тканеинженерные конструкции на основе кератиноцитов, фибробластов и коллагенновой матрицы (Rives et al. 1994, Hunt et al. 2000, Ehrlich 2004).  Одна из первых таких конструкций была предложена в 1983 году – кератиноциты выращивали на поверхности гелеобразного «дермального эквивалента», состоявшего из смеси коллагена, плазмы, ростовой среды и фибробластов кожи (Bell et al. 1983). Преимуществом дермального эквивалента является то, что клетки в нем находятся в активном функциональном состоянии, близком к таковому в коже.

В США был лицензирован и разрешен FDA к применению в клинической практике первый коммерческий тканевой продукт, состоящий из коллагеновой матрицы и донорских аллогенных фибробластов и кератиноцитов – Apligraf. Продукт выпускается компанией Organogenesis Inc. Пересадку этого биопокрытия уже получили около 80.000 пациентов в США. Комплекс Apligraf состоит из биодеградируемой коллагеновой матрицы на основе бычьего коллагена, аллогенных донорских кератиноцитов и фибробластов (Kirsner RS. 1998, Trent, Kirsner 1998).

Другой одобренный FDA двуслойный живой эквивалент кожи HSE (кератиноциты на коллагеновом матриксе с живыми фибробластами) с успехом использовался для лечения язв «диабетической стопы» – во всех случаях в течение 12 – 32 дней была получена 100% эпителизация. Эффект определялся синтезом и выделением живыми клетками импланта 15 различных факторов роста/цитокинов, запускающих процесс регенерации, что было установлено в предварительном лабораторном эксперименте (Brem et al. 2003).

Проводились рандомизированные контролируемые клинические испытания живого двуслойного эквивалента кожи (bilayered skin construct (BSC)), созданного на основе кератиноцитов и фибробластов из кожи новорожденных. Получены хорошие результаты в закрытии венозных и диабетических язв, и особенно в лечении долго незаживающих ран, не отвечающих на другие методы терапии. Иммунной реакции на трансплантат не наблюдалось. Гистологические исследования показали активные стимулирующие взаимодействия между BSC и тканями ран (Badiavas et al. 2002).

В последние несколько лет начаты исследования по возможностям применения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МСК). Поскольку такой клеточный материал аутологичен (в отличие от аллофибробластов), легко культивируется и дифференцируется (в отличие от кератиноцитов), то этот метод в будущем может стать хорошей альтернативой прочим клеточным методам лечения кожных поражений.

После трансплантации МСК на раневую поверхность начинаются сложные процессы  их взаимодействия с клетками окружения. Было показано, что пересаженные МСК ускоряют образование грануляционной ткани; они стимулируют миграцию в рану “клеток воспаления” и “клеток заживления”, секретирующих IL-6, IL-8 и G-CSF, и таким образом инициируют процесс регенерации. С другой стороны, раневое микроокружение индуцирует пролиферацию клеток костного мозга и увеличение экспрессии ими мРНК коллагена, а также стимулирует дифференцировку клеток костного мозга в фибробласты и синтез ими белков экстрацеллюлярного матрикса (Ai et al. 2002).

На крысах было проведено сравнительное изучение влияния трансплантации эмбриональных фибробластов и фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга на заживление глубоких ожоговых ран. Показано, что трансплантация обоих видов клеток на поверхность раны уменьшает клеточную инфильтрацию раны, ускоряет новообразование сосудов и образование грануляционной ткани. Эти изменения создают условия для ускоренного заживления ожоговых ран по сравнению с контролем (без трансплантации клеток). Изучение особенностей процесса заживления ран выявило более высокий темп регенерации под воздействием МСК по сравнению с фибробластами (Шумаков и др. 2002, Shumakov et al. 2003).

Современными исследованиями показана значительная роль стволовых клеток костного мозга (СК КМ) в гомеостазе и регенерации кожи (Badiavas 2004). СК КМ трансгенных по зеленому флюоресцентному белку (GFP – green fluorescent protein) мышей пересаживали мышам без GFP, чтобы выявить их участие в заживлении повреждений кожи. Полученные результаты показали, что значительное число СК КМ мигрирует как в поврежденные, так и в неповрежденные участки кожи. Повреждение стимулирует приживление клеток костного мозга в коже и индуцирует их включение и дифференцировку в клетки кожи (Badiavas et al. 2003). В другом исследовании трансплантации СК КМ от генетически меченых GFP мышей обычным мышам, было выявлено, что в неповрежденной коже приживались как гемопоэтические, так и мезенхимальные СК КМ. 15-20% популяции веретенообразных дермальных фибробластов имели костномозговое происхождение; эти клетки выделяли коллаген I и III типов. На начальных этапах заживления ран в них обнаруживалось много клеток-предшественников эндотелия донорского происхождения, а после завершения эпителизации их не было. Полученные данные показывают, что при заживлении ран в восстановлении эпителия участвуют расположенные рядом клетки эпидермиса, тогда как для восстановления популяции дермальных фибробластов привлекаются как местные мезенхимальные клетки дермы, так и СК КМ (Fathke et al. 2004). 

Аутологичные клетки костного мозга (в сравнении с фибробластами) наносились в места глубоких и поверхностных ранений кожи крыс, сочетанных с радиационным поражением. Кожное введение стволовых клеток костного мозга, также как и фибробластов, приводило к заметному повышению прочности ран на разрыв (примерно в 2 раза по сравнению с контрольной группой) и ускоренному заживлению. Таким образом, имплантация клеток приводила к снижению неблагоприятного влияния радиационного облучения на раны (Dantzer et al. 2003).

Крысам делали внутрикожные инъекции МСК костного мозга и сразу после этого наносили разрезы на всю глубину кожи. Заживление ран у инъецированных МСК крыс шло быстро; оставались очень тонкие шрамы; гистологическое строение коллагена на месте зажившей раны было близко к таковому в неповрежденной коже и сильно отличалось у крыс контрольной группы (не получавших инъекций). Таким образом, МСК обеспечивают заживление ран с регенерацией нормальной структуры дермы (Satoh et al. 2004). Результаты этой работы могут найти применение в косметической хирургии, одной из важных проблем которой является минимизация шрамов.

Изучались возможности стволовых клеток, полученных и из других источников. Выделенные из кожи мультипотентные стволовые клетки культивировали и исследовали их воздействие при системном введении на крыс, получивших одновременно высокую дозу облучения и кожные раны. Было показано, что трансплантация клеток улучшает выживание, ускоряет восстановление гемопоэза и заживление ран. FISH-анализ на У-хромосому показал, что донорские дермальные мультипотентные клетки приживаются как в коже, так и в костном мозге реципиента. FACS-анализ на CD2- и CD25- периферические лимфоциты показал, что трансплантация этих клеток в течение 3 недель не индуцирует явной активации in vivo аллогенных лимфоцитов. Таким образом, установлено, что трансплантация мультипотентных клеток кожи может быть методом лечения при ранениях, сочетанных с радиационным поражением (Shi et al. 2004). Сравнивалось местное и системное введение культивированных дермальных мультипотентных клеток крысам с ранами в сочетании с радиационным поражением или без него. При местном введении эффект наблюдался раньше, но у облученных крыс на заживление ран влияло только системное введение клеток. Было показано, что трансплантированные клетки встраивались в ткани раны и выделяли цитокины и молекулы межклеточного матрикса, стимулирующие пролиферацию фибробластов и клеток эпидермиса (Chunmeng et al. 2004). Исследовалось влияние выделенных из периферической крови гемопоэтических СК (CD34+) на заживление язв на ишемических конечностях больных диабетом. Человеческие СК вводились в глубокие раны мышам с стрептозоциновой моделью диабета. Уже на 4-е сутки размер ран заметно уменьшались, по сравнению с контролем резко ускорялось восстановление эпидермиса и васкуляризация (увеличивалось число и размер новых сосудов) (Sivan-Loukianova et al. 2003). Изучались механизмы, обеспечивающие переход гемопоэтических СК из сосудов в различные ткани, в том числе в кожу, в процессе регенерации этих тканей (Sackstein 2004).

Были подведены предварительные итоги первого клинического применения метода трансплантации стволовых клеток костного мозга на хронические незаживающие раны кожи в Boston University School of Medicine. Аутологичные клетки костного мозга наносились на хронические язвы трем пациентам с повреждениями кожи, незаживающими более года. Положительные результаты у этих пациентов отсутствовали не только после проведения традиционной, но и после применения раневых биоинженерных покрытий и пересадки аутологичной кожи. Полное закрытие ран и восстановление кожи были получены у всех трех пациентов и подтверждены исследованием биопсийного материала. Также были получены клинические и гистологические доказательства снижения процессов рубцевания (Badiavas, Falanga 2003).

Метод аутотрансплантации клеток костного мозга применили к 8-ми больным с хроническими заболеваниями периферических артерий нижних конечностей, у которых традиционное лечение оставалось без эффекта. Улучшение отметили 7 пациентов. В 3-х случаях с наличием язв стоп полное заживление наблюдалось в 2-х и значительное уменьшение язвы в 1 наблюдении. Токсичности и осложнений терапии не наблюдалось. Метод рекомендован к применению в клинической практике. Полученный положительный эффект объясняется главным образом стимуляцией ангиогенеза и улучшившейся в результате трофикой (Esato et al. 2002).

Методы клеточной трансплантологии находят применение и в решении некоторых косметических проблем – инъекции живых фибробластов дают хорошие результаты при лечении различных косметических дефектов кожи – шрамы, угри, морщины и др. Более подробно об этом см. в разделе об использовании клеточных технологий для общего оздоровления.

Литература

Васильев А.В. и др. Создание банка кожных клеточных трансплантатов: принципы и перспективы. Материалы городской научно-практической конференции “Новые медицинские технологии в лечении тяжелообожжeнных” Москва 1997: 27
Смирнов С.В. и др. Восстановление кожного покрова путем трансплантации выращенных кератиноцитов. БЭБМ 2003; 135; 6: 711
Смирнов С.В. и др. Современные методы клеточной терапии при лечении ожогов Хирургия 2003; 12: 58—62
Туманов В. П., Алексеев А. А., Будкевич Л. И. Десятилетний опыт использования культивированных клеток кожи человека для лечения термических ожогов. АРХИВ ПАТОЛОГИИ №4 1999
Шумаков В.И., Расулов М.Ф., Крашенинников М.Е., Зайденов В.А., Онищенко Н.А. Сравнительная оценка эффективности применения аллогенных эмбриональных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для терапии глубоких ожоговых ран. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2002; 4: 7-11
Ai G, Su Y, Yan G, Wang M, Liu X, Xu H, Cheng T. The experimental study of bone marrow mesenchymal stem cells on the repair of skin wound combined with local radiation injury.  Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2002 Dec 10;82(23):1632-6
Asselineau D, Bernard BA, Bailly C, Darmon M, Prunieras M. Human epidermis reconstructed by culture: is it “normal”? J Invest Dermatol. 1986 Feb;86(2):181-6
Badiavas EV, Falanga V. Treatment of chronic wounds with bone marrow-derived cells. Arch Dermatol. 2003 Apr;139(4):510-6
Badiavas EV, Mehrdad Abedi, Janet Butmarc, Vincent Falanga, Peter Quesenberry. Participation of bone marrow derived cells in cutaneous wound healing. J Cell Physiol 2003; 196; 2: 245-250
Badiavas EV, Paquette D, Carson P, Falanga V. Human chronic wounds treated with bioengineered skin: histologic evidence of host-graft interactions. J Am Acad Dermatol. 2002 Apr;46(4):524-30.
Badiavas EV. The potential of bone marrow cells to orchestrate homeostasis and healing in skin. Blood Cells Mol Dis. 2004 Jan-Feb;32(1):21-3.
Bell E, Sher S, Hull B, Merrill C, Rosen S, Chamson A, Asselineau D, Dubertret L, Coulomb B, Lapiere C, Nusgens B, Neveux Y. The reconstitution of living skin. J Invest Dermatol. 1983 Jul;81(1 Suppl):2s-10s.
Brem H, Young J, Tomic-Canic M, Isaacs C, Ehrlich HP. Clinical efficacy and mechanism of bilayered living human skin equivalent (HSE) in treatment of diabetic foot ulcers. Surg Technol Int. 2003;11:23-31
Chunmeng S, Tianmin C, Yongping S, Xinze R, Yue M, Jifu Q, Shufen L, Hui X, Chengji L. Effects of dermal multipotent cell transplantation on skin wound healing. J Surg Res. 2004 Sep;121(1):13-9.
Compton CC, Gill JM, Bradford DA, Regauer S, Gallico GG, O’Connor NE. Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full-thickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting. A light, electron microscopic and immunohistochemical study. Lab Invest. 1989 May;60(5):600-12.
Dantzer D, Ferguson P, Hill RP, Keating A, Kandel RA, Wunder JS, O’Sullivan B, Sandhu J, Waddell J, Bell RS. Effect of radiation and cell implantation on wound healing in a rat model. J Surg Oncol. 2003 Jul;83(3):185-90
Dasgupta S, et al. A modification of split-skin graft. Burns 1997; 23; 6: 509-511
De Luca M, Albanese E, Bondanza S, Megna M, Ugozzoli L, Molina F, Cancedda R, Santi PL, Bormioli M, Stella M, et al. Multicentre experience in the treatment of burns with autologous and allogenic cultured epithelium, fresh or preserved in a frozen state. Burns. 1989 Oct;15(5):303-9
Dvorankova B, Holikova Z, Vacik J, Konigova R, Kapounkova Z, Michalek J, Pradn M, Smetana K Jr.Reconstruction of epidermis by grafting of keratinocytes cultured on polymer support–clinical study. Int J Dermatol. 2003 Mar;42(3):219-23.
Duinslaeger L, Verbeken G, Reper P, Delaey B, Vanhalle S, Vanderkelen A. Lyophilized keratinocyte cell lysates contain multiple mitogenic activities and stimulate closure of meshed skin autograft-covered burn wounds with efficiency similar to that of fresh allogeneic keratinocyte cultures. Plast Reconstr Surg. 1996 Jul;98(1):110-7.
Ehrlich HP. Understanding experimental biology of skin equivalent: from laboratory to clinical use in patients with burns and chronic wounds. Am J Surg. 2004 May;187(5A):29S-33S
Esato K, Hamano K, Li TS, Furutani A, Seyama A, Takenaka H, Zempo N. Neovascularization induced by autologous bone marrow cell implantation in peripheral arterial disease. Cell Transplant. 2002;11(8):747-52.
Fathke C, Wilson L, Hutter J, Kapoor V, Smith A, Hocking A, Isik F. Contribution of bone marrow-derived cells to skin: collagen deposition and wound repair. Stem Cells. 2004;22(5):812-22.
Hunt TK, Hopf H, Hussain Z. Physiology of wound healing. Adv Skin Wound Care. 2000 May-Jun;13(2 Suppl):6-11
Hunyadi J, Farkas B, Bertenyi C, Olah J, Dobozy A. Keratinocyte grafting: covering of skin defects by separated autologous keratinocytes in a fibrin net. J Invest Dermatol. 1987 Jul;89(1):119-20
Kirsner RS. The use of Apligraf in acute wounds. J Dermatol. 1998 Dec;25(12):805-11.
Nanchahal J. Stretching skin to the limit: a novel technique for split skin graft expansion. Br J Plast Surg. 1989 Jan;42(1):88-91
Navsaria HA, Myers SR, Leigh IM, McKay IA. Culturing skin in vitro for wound therapy. Trends Biotechnol. 1995 Mar;13(3):91-100
Oliver AM, Kaawach W, Mithoff EW, Watt A, Abramovich DR, Rayner CR. The differentiation and proliferation of newly formed epidermis on wounds treated with cultured epithelial allografts. Br J Dermatol. 1991 Aug;125(2):147-54.
Oshima H, Inoue H, Matsuzaki K, Tanabe M, Kumagai N. Permanent restoration of human skin treated with cultured epithelium grafting – wound healing by stem cell based tissue engineering. Hum Cell. 2002 Sep;15(3):118-28.
Phillips TJ, Gilchrest BA. Cultured epidermal allografts as biological wound dressings. Prog Clin Biol Res. 1991;365:77-94.
Qaryoute S, et al. Usage of autograft and allograft skin in treatment of burns in children. Burns 2001; 27; 6: 599-602
Qaryoute S, Mirdad I, Hamail AA. Usage of autograft and allograft skin in treatment of burns in children. Burns 2001; 27; 6: 599-602
Rennekampff HO, et al. Acellular human dermis promotes cultured keratinocyte engraftment. J Burn Care Rehabil 1997; 18; 6: 535-544
Rheinwald JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 1975 Nov;6(3):331-43
Rives JM, et al. Cultured epithelial autografts (CEA) clinical applications in extensive burn injuries: Percy Burn Center Experiens. 9th Congress of the International Society for Burn Injuries, 27 June – 1 July, 1994 Paris, France, p.153.
Sackstein R. The bone marrow is akin to skin: HCELL and the biology of hematopoietic stem cell homing. J Invest Dermatol. 2004 May;122(5):1061-9
Satoh H, Kishi K, Tanaka T, Kubota Y, Nakajima T, Akasaka Y, Ishii T. Transplanted mesenchymal stem cells are effective for skin regeneration in acute cutaneous wounds. Cell Transplant. 2004;13(4):405-12.
Shi C, Cheng T, Su Y, Mai Y, Qu J, Lou S, Ran X, Xu H, Luo C. Transplantation of dermal multipotent cells promotes survival and wound healing in rats with combined radiation and wound injury. Radiat Res. 2004 Jul;162(1):56-63.
Shumakov VI, Onishchenko NA, Rasulov MF, Krasheninnikov ME, Zaidenov VA. Mesenchymal bone marrow stem cells more effectively stimulate regeneration of deep burn wounds than embryonic fibroblasts. Bull Exp Biol Med. 2003 Aug;136(2):192-5.
Sivan-Loukianova E, Awad OA, Stepanovic V, Bickenbach J, Schatteman GC. CD34+ blood cells accelerate vascularization and healing of diabetic mouse skin wounds. J Vasc Res. 2003 Jul-Aug;40(4):368-77. Epub 2003 Jul 29
Soejima K, et al. Reconstruction of burn deformity using artificial dermis combined with thin split-skin grafting. Burns 1997; 23; 6: 501-504
Stepanovic V, Ola Awad, Chunhua Jiao, Martine Dunnwald, Gina C. Schatteman. Leprdb diabetic mouse bone marrow cells inhibit skin wound vascularization but promote wound healing. Circ Res 2003; 92 11;: 1247-1253
Teepe RG, Kreis RW, Koebrugge EJ, Kempenaar JA, Vloemans AF, Hermans RP, Boxma H, Dokter J, Hermans J, Ponec M, et al. The use of cultured autologous epidermis in the treatment of extensive burn wounds. J Trauma. 1990 Mar;30(3):269-75.
Terskikh VV, Vasiliev AV. Cultivation and transplantation of epidermal keratinocytes. Int Rev Cytol. 1999;188:41-72.
Thompson CH, Streamer KJ, Baker P, Rose BR, Kennedy PJ, Cossart YE. Transplantation of cultured autologous epidermis to a patient with burns. Med J Aust. 1987 Nov 16;147(10):507-10.
Trent JF, Kirsner RS. Tissue engineered skin: Apligraf, a bi-layered living skin equivalent. Int J Clin Pract. 1998 Sep;52(6):408-13.
Valencia IC, Falabella AF, Eaglstein WH. Skin grafting. Dermatol Clin. 2000 Jul;18(3):521-32.
Wainwright DJ. Use of an accelular allograft dermal matrix (Alloderm) in the management of full-thickness burns. Burns 1995; 21; 4: 243-248